دانشگاه آزاد اسلامی واحد آشتیان
پایان نامه کارشناسی ارشد رشته فیزیولوژی گیاهی
خالص سازی جلبک کلرلا و جدا سازی ترکیبات بیولوژیکی فعال درآن جلبک
استاد راهنما:
دکتر معصومه خسروی رینه
استاد مشاور:مهندس مجتبی یزدانی
دانشجو:معصومه اقرعی آهنگرانی فراهانی
1393
سپاس
حمد و سپاس ذات پاک خداوند بلند مرتبه که بار دیگر درلطف و رحمت بیکران خود را بر من گشود.از استاد ارجمندم سرکار خانم دکتر معصومه خسروی رینه به سبب راهنمایی های بی در یغشان کمال تشکر را دارم، همچنین از استادمشاور جناب آقای مهندس مجتبی یزدانی به سبب کمک های ارزنده شان قدر دانی می کنم.
از اساتید و دانشجویان پژوهشکده گیاهان دارویی جهاد دانشگاهی تهران به سبب کمک در انجام امور مربوط به پایان نامه کمال تشکر را دارم.
همچنین از همکلاسی ها و دوستان عزیزم، برای محبت ها و همراهیشان سپاسگزارم و برایشان آرزوی موفقیت دارم.
معصومه اقرعی آهنگرانی فراهانی
تابستان1393
تقدیم به:
تقدیم به عاطفه پاک پدر و مادر عزیزم
که همواره یار و همراه صادق و وفادار من بوده اند
صورتجلسه دفاع
باتأييدات خداوند متعال جلسه دفاع از پايان نامه كارشناسي ارشد خانم/آقاي معصومه اقرعی آهنگرانی فراهانی
در رشته فیزیولوژی گیاهیتحت عنوان: خالص سازی جلبک کلرلا و جدا سازی ترکیبات بیولوژیکی فعال درآن جلبک
با حضور استادراهنما، استاد (استادان) مشاور و هيأت داوران در دانشگاه آزاد اسلامي واحد آشتیان در تاريخ 24/6/1393 تشكيل گرديد. در اين جلسه ، پايان نامه با موفقيت مورد دفاع قرار گرفت.
نامبرده نمره 7/17 با امتياز بسیار خوب دريافت نمود.

1- استاد راهنما: دكتر معصومه خسروی رینه امضاء تاريخ
2- استاد داور: دکتر شهرام شعاعی امضاء تاريخ
3- مدير گروه آموزشي: دكتر معصومه خسروی رینه امضاء تاريخ
5- رئيس دانشكده تحصيلات تكميلي: مهندس مجتبی یزدانی امضاء تاريخ
معاون پژوهشي دانشگاه آزاد اسلامي واحد آشتیان
دكترراضیه محمدی
فرم شماره20 تعهدنامه اصالت رساله يا پايان‌نامه
ايـنجانب معصومه اقرعی آهنگرانی فراهانی دانـش آموخته مقطع کارشناسي ارشد ناپيوسته در رشـــــــته فیزیولوژی گیاهی که در تاريــــــخ 24/6/93 از پـــايـــان نـــامه / رســاله خود تــحت عــــنوان خالص سازی جلبک کلرلا و جدا سازی ترکیبات بیولوژیکی فعال درآن جلبک با کسب نمره 7/17 و درجه بسیار خوب دفاع نموده‌ام بدين وسيله متعهد مي‌شوم:
اين پايان‌نامه /رساله حاصل تحقيق و پژوهش انجام شده توسط اينجانب بوده و در مواردي که از دستاوردهاي علمي پژوهشي ديگران ( اعم از پايان نامه، کتاب، مقاله و …) استفاده نموده ام، مطابق ضوابط و رويه موجود، نام منبع مورد استفاده و ساير مشخصات آن را در فهرست مربوطه ذکر و درج کرده‌ام.
اين پايان نامه / رساله قبلا براي دريافت هيچ مدرک تحصيلي (هم سطح،پايين تريا بالاتر) در ساير دانشگاه ها و موسسات آموزش عالي ارائه نشده است.
چنانچه بعد از فراغت از تحصيل، قصد استفاده و هرگونه بهره‌برداري اعم از چاپ کتاب، ثبت اختراع و …. از اين پايان‌نامه داشته باشم ، از حوزه معاونت پژوهشي واحد مجوزهاي مربوطه را اخذ نمايم.
چنانچه در هر مقطع زماني خلاف موارد فوق ثابت شود، عواقب ناشي از آن را مي پذيرم و واحد دانشگاهي مجاز است با اينجانب مطابق ضوابط و مقررات رفتار نموده و در صورت ابطال مدرک تحصيلي‌ام هيچ گونه ادعايي نخواهم داشت.
نام و نام خانوادگي :
تاريخ و امضاء :معصومه اقرعی آهنگرانی فراهنی
*توجه: این فرم بایستی قبل از فهرست مطالب در پایان نامه صحافی شود.
فهرست
فصل اول مروری بر منابع1
1-مروری بر منابع ……………………………………………………………………………………………………………2
1-1-ریز جلبک ها …………………………………………………………………………………………………………..2
1-1-1-شرایط رشد ریز جلبک ها …………………………………………………………………………………….4
1-2-تاریخچه Chlorella Vulgaris ………………………………………………………………………………5
1-3- خواص Chlorella Vulgaris ……………………………………………………………………………….6
1-4- رده بندی Chlorella ……………………………………………………………………………………………..8
1-5- Chlorella Vulgaris و مطالعات زیست پزشکی ……………………………………………………..8
1-6- روش های غربالگری، خالص سازی و شناسایی ریز جلبک ها …………………………………..10
1-6-1- روشهاي تهيه ريزجلبكها …………………………………………………………………………………….11
1-6-1-1-خريداري ازمراكز فروش ريزجلبكها …………………………………………………………………11
1-6-2-غربالگری ………………………………………………………………………………………………………….12
1-6-2-1-غربالگري از خاستگاههاي طبيعي ……………………………………………………………………..12
1-6-3- غني سازي محيط كشت …………………………………………………………………………………….13
1-6-4- جداسازي مستقيم ……………………………………………………………………………………………..14
1-6-5- توليد كشت خالص …………………………………………………………………………………………..15
1-6-6- شناسايي ريزجلبكهاي جداشده …………………………………………………………………………..18
1-6-6-1- شناسايي ريزجلبكها به كمك آناليز مولكولي 18S rDN………………………………………19
1-6-6-2- انجام عمليات BLAST جهت شناسايي سويه ريزجلبك ……………………………………..20
1-7- تکنیک های استخراج از جلبک ها …………………………………………………………………………21
1-7-1- استخراج سیال فوق بحرانی ……………………………………………………………………………….25
1-7-2- استخراج مایع تحت فشار …………………………………………………………………………………..30
1-7-3- استخراج با آب داغ تحت فشار(PHWE) …………………………………………………………..34
1-7-4- استخراج با کمک اولترا سوند (UAE) و استخراج با کمک مایکروویو (MAE)…………36
1-8- مهمترین ترکیبات فعال زیستی استخراج شده از جلبک ها ………………………………………….37
1-8-1- آنتی اکسیدان ها ……………………………………………………………………………………………….37
1-8-2-فلاوونوییدها …………………………………………………………………………………………………….39
1-8-2-1- بیوسنتز فلاوونوئیدها ……………………………………………………………………………………..40
1-8-2-2- انواع فلاوونوئیدها …………………………………………………………………………………………41
1-9- لیپیدها …………………………………………………………………………………………………………………42
1-10- کربوهیدرات ها …………………………………………………………………………………………………..44
1-11- پپتیدها و پروتیین ها ……………………………………………………………………………………………44
فصل دوم مواد و روش ها46
2-2-آماده کردن محیط کشت BG-11 ……………………………………………………………………………50
3-2- نحوه خشک کردن نمونه ها ……………………………………………………………………………………53
2-3- تهیه عصاره متانولی گیاهان …………………………………………………………………………………….53
2-4- تعیین فلاونوئید کل ……………………………………………………………………………………………….54
فصل سوم نتایج59
3-1- نتایج حاصل از سنجش فلاوونوئید کل …………………………………………………………………….60
3-2- نتایج حاصل از سنجش فعالیت روبش رادیکال DPPH …………………………………………….62
3-3- نتایج حاصل از سنجش بتا کارتنوئید ……………………………………………………………………….63
3-4- نتایج حاصل از آنالیز آماری ……………………………………………………………………………………64
بررسی نمودار ………………………………………………………………………………………………………………..72
3-4- تفسیر نتایج …………………………………………………………………………………………………………74
فصل چهارم بحث نتیجه گیری و پیشنهادات76
نتیجه گیری …………………………………………………………………………………………………………………..86
پیشنهادات …………………………………………………………………………………………………………………….88
فهرست منابع89
منابع فارسی ………………………………………………………………………………………………………………….89
منابع لاتین …………………………………………………………………………………………………………………….91
جداول
جدول2-1- مواد تشکیل دهنده محیط کشت Chu…………………………………………………………………….48
جدول2-2- مواد تشکیل دهنده محیط کشت BG-11………………………………………………………………. 51
جدول 3-1- نتایج حاصل از سنجش فلاوونوئید کل ……………………………………………………………….. 60
جدول3-2- نتایج حاصل از فعالیت روبش رادیکال DPPH …………………………………………………….. 61
جدول3-3-جداول مربوط به آنالیز آماری t-test ……………………………………………………………………… 62
نمودارها
نمودار3-1- نمودار کوئرستین سنجش فلاوونوئید کل …………………………………………………………….. 61
نمودار3-2- نمودار کوئرستین سنجش فعالیت روبش رادیکال DPPH ……………………………………… 62
نمودار3-3-میانگین فعالیت روبش رادیکال DPPH ……………………………………………………………….. 63
نمودار3-4- میانگین جذب آنتی اکسیدان ………………………………………………………………………………. 72
نمودار3-5- میانگین جذب روبش رادیکال DPPH………………………………………………………………… 73
اشکال
تصویر 1-1- شکل شماتیک برای استخراج سیال فوق بحرانی ………………………………………………… 30
تصویر1-2- شکل شماتیک برای استخراج با مایع تحت فشار………………………………………………….. 33
تصویر 1-3- دستگاه تابش اولترا سونیک/مایکرویو ………………………………………………………………… 36
چکیده:
جلبک ها و ریز جلبک ها به عنوان منابع اصلی ترکیبات غذاهای عملکردی مورد استفاده قرار گرفته اند.و این جلبک ها به عنوان اهداف کلیدی برای دستیابی به ترکیبات فعال زیستی مطرح هستند. ترکیبات موجود در این جلبک ها می توانند فعالیت ضد فشار خون بالا، اثرات کاهشی بر روی کلسترول، خواص آنتی اکسیدانی یا اثرات تنظیمی بر روی اشتها داشته باشند که به صورت تجاری هم عرضه می شود. از بین ریز جلبک ها Chlorella Vulgaris یکی از مواد ی است که بیشترین تحقیقات علمی در مورد آن انجام شده است واولین ریز جلبکی بود که به طور گسترده به عنوان منبع غذایی کشت شد. این ریز جلبک سبز تک سلولی دارای ارزش غذایی بالا شامل پروتیین ها، کربو هیدرات ها، لیپیدها، کارتنوییدها، آنتی اکسیدان، ترکیبات محرک ایمنی، ویتامین ها، پلی ساکارید، مواد معدنی، عامل منحصر بفرد CGF (فاکتور رشدکلرلا) است هرگاه يافتن نوع به خصوصي از ريزجلبكها با خصوصياتي ويژه از خاستگاه و محيط هاي طبيعي آنها موردنظرباشد بايد به روشهاي غربالگري متوسل شويم گام اول در جداسازي يك ريزجلبك از خاستگاه طبيعي آن، انتخاب نوع محيط زيست ريزجلبك با شرايطي ويژه بر اساس اهداف نهايي تحقيق است. مرحله اصلي و مهم در غربالگري ايجاد يك كشت خالص است. به عبارت ديگر در اين مرحله تلاش مي شود نمونه مشخصي از ريزجلبك كه فاقد هر نوع ارگانيسم ديگري از جمله باكتري، قارچ، پروتوزوا و غيره باشد، موردكشت قرارگيرد. در مطالعه حاضر نمونه ها به طور مکرر از مناطق مختلف همچون عباس آباد شازند، خنداب، سراب گیان نهاوند و میادین مختلف شهر اراک جمع آوری شد و با واکشت های مختلف در دو محیط کشت مایع و جامد Chu خالص سازی نمونه ها انجام شد.سپس نمونه های جلبکی Chlorella طی مراحلی خشک شد و فرایندهای مربوط به عصاره گیری انجام شد. و مقادیر فلاوونوئید، بتاکاروتنوئید، فعالیت آنتی اکسیدانی سنجیده شد و با استفاده از نرم افزارspss داده ها مورد ارزیابی و آنالیزقرار گرفت. نتایج واکشت های مختلف بهترین شرایط برای رشد Chlorella را در محیط کشت Chu به دست آورد. نتایج جذب با دستگاه اسپکترو فتومتری مقدار 67/494میلی گرم بر میلی لیتر اسید آسکوربیک ، 447/0بتا کاروتنوئید و مقادیر بسیار اندکی از فلاوونوئیدها را برای Chlorella Vulgaris تعیین کرد. مطالعه ای که توسط Wang و همکارانش در سال 2010 انجام شد مقادیر بالایی از لیپید ها و کارتنوئید ها را در جلبکChlorella vulgaris تعیین کرد اما مقدار فلاوونوئید حاصل در این مطالعه بسیار ناچیز بود (019/0) که نتایج مطالعه حاضر را تآیید می کند که ممکن است به دلیل روش های مختلف کشت و نوع حلال های به کار رفته در این بررسی باشد وبرای تعیین مقادیر ترکیبات زیستی به ویژه فلاوونوئیدها روش های استخراج پیشترفته تر و تغییر در شرایط کشت را پیشنهاد می کند.
کلمات کلیدی: Chlorella vulgaris ، محیط کشت Chu و BG-11 فلاوونوئید، بتا کارتنوئید، آنتی اکسیدان
مقدمه
وقوع و شیوع بیماری های مختلفی همچون سرطان، بیماری های قلبی-عروقی، چاقی، و دیابت ممکن است مربوط به رژیم غذایی پر کاری و ترکیبی از سبک زندگی بی تحرک باشد. مفهوم غذاهای عملکردی1 اولین بار در ژاپن ظاهر شد جایی که این مفهوم به عنوان وسیله ای برای افزایش سلامتی و سالم زیستن در نظر گرفته شده بود. این مفهوم سپس در کشور های اروپایی به میزان زیادی توسعه یافت.محیط دریا که شامل تنوعی از موجودات با خواص زیستی بی نظیر است یکی از عمده ترین منابع غذایی برای دستیابی به مفهوم غذاهای عملکردی می باشد. تا این تاریخ جلبک ها و ریز جلبک ها به عنوان منابع اصلی ترکیبات غذاهای عملکردی مورد استفاده قرار گرفته اند.و این جلبک ها به عنوان اهداف کلیدی برای دستیابی به ترکیبات فعال زیستی مطرح هستند (Ibañez , et al,2012).
جلبکها گروه بزرگی از گیاهان هستند که از لحاظ شکل و اندازه ، تنوع وسیعی دارند. برای اولین بار ، لینه2 گیاه شناس ، در سال 1754 ، این گیاهان را با نام آلجی معرفی کرد. رومیها از واژه fucus ، چینیها از واژه tsao و مردم هاوایی از واژه limo برای معرفی این گیاهان استفاده می‌کردند. در تقسیمات جهانی گیاهی ، جلبکها 1800 جنس و 21000 گونه دارند. بیشتر جلبکها ، آبزی هستند. در جلبکها هر سلول دارای 1 تا 2 عدد کلروپلاست و بندرت دارای کروماتوفور هستند. در جلبکها ساختارهای تولید مثلی بطور کامل به هاگ یا گامت تبدیل می‌شوند. جلبکها یا یوکاریوت یا پروکاریوت هستند. تولید مثل در جلبکها به دو طریق جنسی و غیر جنسی صورت می‌گیرد. جلبکها فاقد هر نوع منفذ یا روزنه هستند و ریزوئیدها در آنها در صورت وجود بسیار ساده است. اندامهای جنسی در جلبکها تک سلولی یا پرسلولی است . ذخیره غذایی در جلبکها ، نشاسته است و به صورت اتوتروف زندگی می‌کنند و دیواره سلولی در آنها از سلولز تشکیل شده است.
ترکیبات موجود در این جلبک ها می توانند فعالیت ضد فشار خون بالا، اثرات کاهشی بر روی کلسترول، خواص آنتی اکسیدانی یا اثرات تنظیمی بر روی اشتها داشته باشند که به صورت تجاری هم عرضه می شوند.جلبک ها یک گروه ناهمگن و پیچیده از موجوداتی را تشکیل می دهند که به واسطه ماهیت فتوسنتتیک3 آنها و ساختارهای ساده تولید مثلی شناخته شده اند. جلبک ها بر اساس اندازه خود می توانند به دو گروه موجودات تک سلولی با عنوان میکرو جلبک ها4 و موجودات پرسلولی با نام ماکروجلبک هاشناخته می شوند. جلبک ها به طور فراوانی در محیط های با میزان زیادی از نور، نمک و دما زندگی می کنند. به منظور سازگاری با این شرایط حاد بیشتر جلبک ها دامنه متنوعی از متابولیت های 5ثانویه راتولید می کنند که اغلب فعالیت های زیستی بالقوه ای دارند. کشت یا تولید اکثر جلبک ها در مقیاس صنعتی ساده است. بنابراین تولید ترکیبات فعال زیستی مشتق از جلبک ها ممکن است توسط انتخاب شرایط کشت مناسب تنظیم شود. نحوه به دست آوردن ترکیبات زیستی از میکرو و ماکروجلبک ها به عنوان یک منشأ جدید از اهمیت زیادی برخوردار است. در این رابطه یک نیاز اساسی برای ترکیب مناسب، انتخاب، هزینه مؤثر و روشهای استخراج مناسب و سازگار با محیط زیست با در نظر گرفتن ملزومات قانونی برای حلال های مناسب غذایی و روش های صحیح وجود دارد( .(Sharma ,et al 2012 در مطالعه حاضر نمونه برداری جلبک Chlorella vulgaris از مناطق مختلفی همچون عباس آباد شازند، خنداب، پارک های ملایر، سراب گیان نهاوند و میدان شریعتی شهر اراک انجام شد و سپس نمونه ها برای انجام خالص سازی با استفاده از واکشت های مختلف به آزمایشگاه منتقل شد برای رشد این جلبک از محیط کشت های جامد و مایع Chu و BG-11استفاده شد. و مقادیر فلاوونوئید ، کاروتنوئید و فعالیت آنتی اکسیدانی با استفاده از فعالیت روبش رادیو اکتیو سنجیده شد و آزمایش ها در سه تکرار انجام شد در نهایت با استفاده از نرم افزار SPSS نتایج آماری تجزیه و تحلیل شد.
اهداف
هدف از مطالعه حاضر شامل جمع آوری جلبکها شناسایی خصوصیات تاکسونومیکی جنس با استفاده از کلیدهای شناسایی معتبر، تهیه محیط کشت و انتخاب محیط کشت موثر، جداسازی و خالص سازی جنس chlorella، شناسایی و جداسازی ترکیبات فعال بیولوژیکی موجود در جنس(فلاوونوئید، بتاکارتنوئید، انتی اکسیدان(اسیدآسکوربیک))، است.
فصل اول
مروری بر منابع
1-مروری بر منابع
1-1-ریز جلبک ها
ریز جلبک ها کارخانه های سلولی هدایت شده با نور خورشید هستند که دی اکسید کربن را به سوخت های زیستی بالقوه ، غذا و ترکیبات فعال زیستی با ارزش بالای غذایی تبدیل می کنند. این جلبک ها در مقایسه با فرآورده های رایج غذایی، بهره وری بیشتر، محتوای لیپید و پروتیین نسبتا بالایی دارند و به زمین های مزروعی و آب تازه وابسته نیستند. در دهه گذشته بیوتکنولوژی ریز جلبک ها یک گزینه قابل توجه برای به دست آوردن غذا و مولکولهای زیستی متشکل از پروتیین ها، ویتامین ها، رنگدانه ها، اسیدهای چرب غیر اشباع چندگانه 6و موادی با فعالیت های ضد توموری و تعدیل کننده سیستم ایمنی بوده است. برخی از فواید ریز جلبک ها شامل کنترل فشار بالا، درمان کولیت7 اثرات آنتی توموری است. (Yusof, et al, 2013) امروزه علاقمندی زیادی در رابطه با تولید لیپیدها از انواع ریز جلبک ها وجود دارد. از لحاظ تئوری ریز جلبک ها قادر به تولید مقادیر بالاتری از لیپید نسبت به دیگر محصولات مرسوم هستند بنابراین منبع بالقوه ای برای سوختهای زیستی به شمار می روند. همچنین مشخص شده که ریز جلبک ها دارای مقادیر بالایی از آنتی اکسیدان های8 طبیعی هستند. این ریز جلبک ها به دلیل غنی بودن لیپید هایشان از اسید های چرب امگا-39 با زنجیره بلند 10EPAو DHA11 می توانند منبع قابل ملاحظه ای از اسید های چرب تغذیه ای در مقایسه با روغن ماهی فراهم آورند. ریز جلبک ها میکرو ارگانیسم هایی فتوسنتتیک هستند که انرژی نوری، آب و دی اکسید کربن را به توده زیستی جلبک تبدیل می کنند. اصول کشت ریز جلبک ها مشابه کشت در باکتریها، قارچها و مخمرهاست، تنها از لحاظ ترکیبات محیط کشت و جنبه فتوسنتتزی از هم متمایزند. ریز جلبک ها به طور ویژه ای در تبدیل انرژی خورشیدی مؤثر هستند. چندین گونه از ریز جلبک ها غنی از روغن هستند، محتوای روغنی برخی ریز جلبک ها حدود 80% وزن خشک آنها در شرایط محصول کامل است. ریز جلبک ها شامل دو نوع، لیپیدهای خنثی و لیپیدهای قطبی هستند. فسفولیپیدها و گلیکولیپیدها، لیپیدهای قطبی هستند فسفولیپیدها در ساختار غشایی تجمع یافته اند و گلیکولیپیدها در غشای اندامک های فتوسنتز کننده به طور غالب وجود دارند. لیپیدهای خنثی به طور ویژه شامل مونو ، دی و تری اسیل گلیسرول هستند. این لیپیدها به دنبال یک کمبود در اندامک هایی نظیز کلروپلاست ذخیره می شوند. اسیدهای چرب غیر اشباع به ندرت در سلول به صورت آزاد یافت می شوند بلکه عمدتا در ذخایر لیپیدی همچون تری گلیسریدها قرار دارند. ریز جلبک ها از فتوسنتز برای تثبیت دی اکسید کربن با استفاده از آنزیم Rubisco استفاده می کنند.Plaza, et al,2009, Liang, et al, 2009.sharma,2012)).
1-1-1-شرایط رشد ریز جلبک ها
رشد جلبک تحت تأثیر فاکتور های متعددی همچون ریز مغذی ها، شوری، pH، دما و نور(شدت و مدت زمان) است.در بین این عوامل، نور که به طور مستقیم مکانیسم فتوسنتز را تحت تأثیر قرار می دهد یک عامل مهم در تعریف شرایط مناسب برای کشت است. فتوسنتز فیتوپلانکتون ها توسط فاکتور های طبیعی همچون دما و پرتودهی کنترل می شود. این فاکتورها ارزش غذایی فیتوپلانکتون ها همچون پروتیین، لیپید، کربوهیدرات، اسید های آمینه و ترکیبات رنگدانه دار را متأثر می کنند. مطالعات، اثرات پرتودهی و دوره نوری روی توده زیستی و ترکیب اسید های چرب Chlorella vulgaris را بررسی کرده اند. مدت زمان زیادی است که اثرات زیان آور تابش مستقیم نور بر روی کشت جلبک مشخص شده است. تحت شرایط کشت طبیعی شعاع مستقیم نور خورشید بندرت روی جلبک قرار می گیرد و موقعیت قرار گیری آن چند سانتیمتری داخل آب برای کاهش اثرات مضر کافی است. در زیستگاه های طبیعی جلبک ها به طور غالب در نور کاهش یافته رشد می کنند از اینرو برای اجتناب از تابش مستقیم نور کشت بایستی در پنجره قرار بگیرد.( Ryckebosch, et al,2011).
1-2-تاریخچه Chlorella Vulgaris
Chlorella یکی از قدیمی ترین گیاهان روی کره زمین است. Chlorella بالاترین میزان کلروفیل را در بین گیاهان شناخته شده جهان دارد که همین خصوصیت باعث ایجاد رنگ سبز تیره آن شده است . نام Chlorella بر گرفته از ,واژه یونانی « chloros » به معنی سبز وپسوند لاتین «ella» به معنی کوچک می باشد. با وجود اینکه Chlorella از زمان آغاز حیات بر روی کره زمین وجود داشته است و کشف آن به سال 1890  بوسیله میکرو بیولوژیست آلمانی به نام M.W.Beijerinck   بر می گردد ولی تا سال1940 بطور جدی مورد مطالعه قرار نگرفت. و پروفسور Beijerinck  برای اولین بارChlorella را در آزمایشگاه شخصی اش پرورش داد بیوشیمیست و فیزیولوژیست سلولی آلمانیOtto Heinrich Warburg در سال 1931 برای مطالعه بر روی تنفس سلولی همچنین بررسی فتوسنتز Chlorella موفق به دریافت جایزه نوبل شد و در دهه 1940 ژاپنی‌ها شروع به مطالعه وسیع‌تری درباره آن کردند. شهرت امروزهChlorella بیشتر مرهون تلاش آن‌ها برای شناخت این جلبک است.
ژاپن برای اولین بار در جهان برای گسترش تکنولوژی پرورش Chlorella پیشگام شد. Chlorella به دلیل داشتن دیواره سلولی سخت و نفوذناپذیر ، در صورت مصرف مستقیم سلول غیر قابل استفاده و مواد مغذی داخل آن غیر قابل دسترس می باشد. فرایند منحصر به فرد شکستن دیواره سلولی این گیاه در حالیکه مواد مغذی داخل سلول دست نخورده باقی بماند اولین بار به وسیله یک شرکت ژاپنی با موفقیت انجام شد.(Simon,2000)
1-3- خواص Chlorella Vulgaris
از بین ریز جلبک ها Chlorella Vulgaris یکی از مواد ی است که بیشترین تحقیقات علمی در مورد آن انجام شده است ) واولین ریز جلبکی بود که به طور گسترده به عنوان منبع غذایی کشت شد. این ریز جلبک سبز تک سلولی دارای ارزش غذایی بالا شامل پروتیین ها،کربو هیدرات ها، لیپیدها، کارتنوییدها، آنتی اکسیدان، ترکیبات محرک ایمنی، ویتامین ها، پلی ساکارید، مواد معدنی، عامل منحصر بفرد 12CGF (فاکتور رشد کلرلا) است2009) . (Morris et al این ریز جلبک به عنوان یک غذای سالم، مکمل غذایی و همچنین در صنعت دارویی و آرایشی کاربرد دارد. به دلیل کامل بودن منابع غذایی Chlorella می توان آنرا به تنهایی به عنوان یک غذای کامل برای یک دوره طولانی استفاده نمود. محققان ناسا نیز در مورد استفاده از آن به عنوان غذای فضا نوردان در طول سفرهای فضایی تحقیقاتی داشته اند.
مکمل به دست آمده از این جلبک می تواند به صورت کپسول ،قرص، مواد افزودنی غذایی یا به صورت عصاره مایع مورد استفاده قرار بگیرد Chlorella vulgarisبه صورت تجاری به عنوان مکمل غذایی یا افزودنی به غذاهایی همچون حبوبات و یولاف عرضه شده است. (Yusof, et al 2012, Morris et al, 2009). گزارش های جدید حاکی از این است که مقادیر تولید Chlorella سالیانه به میزانه 2000 تن است. و توده زیستی آن در غنی سازی پروتیین غذاهای رایج و فرمولاسیون غذاهای عملکردی و مکمل های غذایی کاربردی است . اخیرا برخی از گونه های آن به عنوان منشأ سوخت های دیزلی شناسایی شده اند. مشخصات لیپیدهای توده زیستی به دست آمده از این جنس نشان داده که Chlorella vulgaris به عنوان ماده خام برای سوخت های زیستی مناسب است. جلبک های سبز یکی از گروه های عمده تاکسونومیکی13 هستند که کاربرد عمده آنها به عنوان منبع تولید سوخت های زیستی به علت غنی بودن آنها از لیپید است و به عنوان منبع ضروری اسیدهای چرب برای تغذیه انسانی و حیوانی به شمار می رود.
یکی از روش های تحقیقی عمده ارزیابی Chlorellaبه عنوان منبع تولید پروتیین بوده است اماChlorella یک دیواره سلولزی قوی دارد و پروتیین حاصل از آن نتایج ضعیفی خواهد داشت. روش هیدرولیز آنزیمی به عنوان یک روش نوید بخش میزان هضم پروتیینی را افزایش داده است. .(Morris et a,2009)
1-4- رده بندی Chlorella
Chlorella یک جنس از جلبک های سبز تک سلولی است. شکل آن کروی و حدود 10-2 میکرومتر قطر دارد و فاقد تاژک می باشد. این ریز جلبک حاوی رنگدانه های فتوسنتزی سبز کلرو فیل a و b در کلروپلاست خودش است و از لحاظ سیستماتیکی متعلق به (سلسله Plantae، شاخه Chlorophyt، رده Trebouxiophyceae، راسته Chlorellales، خانواده Chlorellaceae، جنس Chlorella) است(Gonzalez, et al,2013). و گونه های آن شامل:
Chlorella minutissima
Chlorella autotrophica
Chlorella variabilis
Chlorella pyrenoidosa
Chlorella vulgaris است.
1-5- Chlorella Vulgaris و مطالعات زیست پزشکی14
این ریز جلبک توجه قابل ملا حظه ای در برنامه های کاربرد ریز جلبک ها در تغذیه و زیست پژشکی به خود اختصاص داده است. و تأ ثیرات مثبت آن در مطالعات انسانی و جانوری در ژاپن و ایالات متحده شناخته شد. مطالعات نشان داه اند که این نوع جلبک باعث کاهش تکثیر و القا آپوپتوز15 دودمان سلول های سرطانی کبد می شود. مطالعات در بدن موجود زنده اثرات ضد توموری و ضد سمیتی این جلبک را آشکار ساخته است. همچنین بررسی ها نشان داده اند عصاره حاصل از این جلبک متاستاز ناشی ازتومور فیبروسارکومای موشی را سرکوب می کند.تحقیقات نشان داده عصاره به دست آمده ازChlorella vulgaris در مقایسه با دیگر جنس های ریز جلبک ها از محتوای آنتی اکسیدانی بیشتری برخوردار است.در مطالعات جانوری عصاره گرفته شده از Chlorella vulgaris اثرات ضد التهابی، ضد توموری و ضد کلسترولی را آ شکار ساخت. همچنین مشخص شده است که عصاره Chlorella vulgaris باعث القا آپوپتوسیس می شود. بنابراین گونه های ریز جلبک ها به ویژه Chlorella vulgaris می تواند برای توسعه فرآورده های آنتی اکسیدانی و ضد سرطانی سودمند باشد. ( Wang, et al,2010) عصاره استخراج شده با آب داغ حاصل از Chlorella vulgaris باعث تخریب DNA و القا آپوپتوسیس در سلولهای سرطانی کبد می شود(Yusof, et al,2012 (. در مطالعه ای اثر عصاره Chlorella بر روی بیان پروتیین های تنظیمی آپوپتوسیس در موش های صحرایی القا شده با سرطان کبد به اثبات رسیده استAzamai, et al,2010) ( .
برخی از تحقیقات اثر Chlorella بر روی پوست را به اثبات رسانده اند به طوری که مشخص شده Chlorella اثرات ضد کلاژناز16 و ضد الاستاز و یک اثر تحریکی بر روی سنتز کلاژن دارد Chlorella باعث افزایش بیان elafin شده و بنابر این از تخریب الاستین جلوگیری می کند همچنین نشان داده شده که Chlorella بر روی پروتیین های اتصالی اپیدرمی دارای اثرات مثبتی است. این نوع ریز جلبک پوست را از اثرات سیستم ایجاد کننده رادیکال های آزاد و در نتیجه پیر شدن پوست حظ می کند.(Smiley, et al,2005).
1-6- روش های غربالگری17، خالص سازی و شناسایی ریز جلبک ها
با توجه به اهميت روزافزون ريزجلبكها و به دليل كاربردهاي فراوان آنها در توليد غذاي انسان و دام و همچنين به علت تركيبات ارزشمندي كه توليد مي كنند، در اينجا لازم است روشهاي متداول درجداسازي، شناسايي و كشت اين ميكروارگانيسمها مختصراً مورد بحث قرارگيرد. Prescott et al1992,Kuzmina,2004).)
1-6-1- روشهاي تهيه ريزجلبكها
به طوركلي، جهت به دست آوردن سويه هاي ريزجلبكي دو راهكار اصلي دنبال مي شود. در راهكار اول جنس، گونه و حتي سويه ثبت شده در كلكسيونهاي معتبر دنيا را سفارش داده و خريداري مي كنند و در راهكار دوم، با استفاده از روشهاي غربالگري اين قبيل موجودات از طبيعت جداسازي، خالص سازي و مورد شناسايي قرارمي گيرند. Prescott et al1992,Kuzmina,2004).)
1-6-1-1-خريداري ازمراكز فروش ريزجلبكها
فهرستي از مراكز معتبر عرضه و فروش ريزجلبكها به همراه آدرس اينترنتي آنها در پيوست آمده است. اين مراكز، انواع مختلفي از ريزجلبكهاي شناسايي شده و خالص را ارائه مي دهند. با سفارش و خريداري از اين كلكسيونها كه در آنها هر سويه با كُد و شماره اي مشخص مي شود مي توان منبع كاملاً خالصي از ريزجلبكها را در اختيار گرفت. كلكسيون جلبكها و سيانوباكتريهاي دانشگاه تورنتو کانادا يكي از معتبرترين اين مراكز است كه با داشتن بيش از 500 جنس و گونه مختلف (UTCC)18 ريزجلبكي به صورت كشت مايع و جامد، سويه هاي مورد نياز را در اختيار محققين قرارمي دهد. در ایران هم پارک علم و فن آوری خلیج فارس اقدام به جمع آوری و کشت سویه های مختلف جلبکی کرده و به مطالعه محققین می تواند سودمند باشدPrescott et al1992,Kuzmina,2004).)
1-6-2-غربالگری
هرگاه يافتن نوع به خصوصي از ريزجلبكها با خصوصياتي ويژه از خاستگاه و محيط هاي طبيعي آنها موردنظرباشد بايد به روشهاي غربالگري متوسل شويم. به عنوان مثال اگر هدف، پيداكردن سويه ريزجلبكي موثر بر آلاينده هاي محيط زيست باشد يكي از روشهاي توصيه شده آن است كه در محل آلودگي با آلاينده به جستجوي ريزجلبكهاي مقاوم يا تجزيه كننده آن بپردازيم. مرحله پس از يافتن سويه، خالص سازي، شناسايي و كشت بهينه آن در محيط آزمايشگاهي خواهد بود. بررسي چگونگي و ميزان حذف آلاينده هاي طبيعي توسط سويه غربال شده در مرحله بعدي قراردارد. غربالگري به طور عمده در چند مرحله انجام مي گيرد كه در ادامه بحث مي شود(2008.( Jhon DM et al, 2002, Shokravi
1-6-2-1-غربالگري از خاستگاههاي طبيعي
گام اول در جداسازي يك ريزجلبك از خاستگاه طبيعي آن، انتخاب نوع محيط زيست ريزجلبك با شرايطي ويژه بر اساس اهداف نهايي تحقيق است. به عبارت ديگر، جستجو در زيستگاههاي مناسب به منظور افزايش احتمال يافتن نوع خاصي از ريزجلبك، مراحل بعدي بخصوص مرحله خالص سازي يك سويه با ويژگي هاي مطلوب را آسانتر مي سازد. به طور عمده، نمونه هاي خاك و آب ممكن است از مناطق مختلفي مانند چشمه هاي آب گرم، يخهاي قطبي، فاضلابهاي صنعتي، شاليزارها19 و بسياري از زيستگاههاي ديگر جمع آوري شوند. بنابراين با توجه به هدفي كه در نظرگرفته مي شود، زيستگاه مناسب جهت جداسازي ريزجلبكها انتخاب مي گردد. مثلاً اگر هدف جداسازي يك گونه سرمادوست باشد مي توان نمونه را از زيستگاههايي نزديك مناطق سردسير تهيه كرد. در مواردي نمونه هاي حاوي ريزجلبكها جمع آوری شده بايد فيلترشوند و در مواردي نيز نمونه مستقيماً و بدون نياز به انجام مرحلة اضافي جهت جداسازي و غربالگري، مورد استفاده قرارمي گيرند. در مواردي كه گونه هاي ريزجلبكي به صخره ها و پوسته صدف ها چسبيده اند بايد با تراشيدن، آنها را از سطوح جدا نمود Shokravi ,et al,2007, Bellinger, et al 1992 )).(اسماعیلی ساری و همکاران، 1379).
1-6-3- غني سازي محيط كشت
در اين روش، شرايط مناسب جهت رشد و تكثير يك گروه خاص مثلاً ريزجلبكهاي فتوسنتزكننده فراهم مي شود؛ درحاليكه در آن شرايط ساير ريزجلبكها رشدنمي كنند. مثلاً براي جداكردن يك ريزجلبك فتوسنتزكننده از خاك ابتداء 5 تا 10 ميلي گرم از نمونة خاك را به 5/2 تا 3 میلی لیتر از محيط كشت مناسب جهت رشد ريزجلبكها اضافه مي كنيم و به مدت 3 هفته آنها را در پليت هاي ميكروبيولوژی، در دماي25 درجه سانتيگراد نگهداري مي كنيم. در صورت نوردهي مناسب به همراه دميدن هواي حاوي 5 درصد دی اكسيدكربن، پس از طي مدت زماني، آثار رشد ريزجلبكهای موجود قابل مشاهده خواهد بود. سلولهای رشديافته در پليت های اوليه را در مرحله بعد به پليت های جديدی منتقل مي كنيم تا ريزجلبك هدف جداسازی گردد. محيط كشت حاوی املاح و آگار براي جداسازی انواع فتوسنتزكننده و محيط كشت حاوی يك تركيب آلی كربندار برای رشد انواع ميكسوتروف20 قابل استفاده خواهد بود. به دنبال چند مرحله تكرار روند مذكور و تعويض محيط كشت، در نهايت به جداسازی و خالص سازی يك سويه مشخص از ريزجلبكها خواهيم رسيد. در مواردي كه نمونه های آب حاوی ريزجلبكها مورد نظر باشد يك تيمار اوليه ضروری است. در اين حالت، با عبوردادن نمونه ازصافی مناسب و به دنبال آن شستشوی توده سلولی پشت صافی با آب مقطر استريل، باقيمانده به محيط حاوی آگار اضافه می شود. پس از2 الی3 هفته انكوباسيون در شرايط نوری و دمايی مناسب، كلنی های پديدارشده به صورت استريل به محيط مايع و استريل منتقل می گردند تا توده زيستی كافی ایجاد گردد. . (Bellinger, et al,1992)
1-6-4- جداسازي مستقيم
در اين روش به كمك ميكروپيپت يا فيلدوپلاتين سلولهاي تكي و يا رشته هاي تشكيل شده ازريزجلبك هدف از خاستگاه طبيعي آن برداشت شده و بر سطح يك پليت آگاردار انتقال مي يابد. در يك روش مشابه، به كمك نوعي دستگاه اسپري كننده، نمونه برداشته شده از منبع اوليه به صورت قطرات بسيار ريز روي سطح پليت اسپري مي گردد. پس از انكوباسيون، تك كلونيهاي پديدآمده از سطح آگار برداشته شده و به محيط كشت مايع منتقل مي گردند. (Bellinger, et al,1992)
1-6-5- توليد كشت خالص
مرحله اصلي و مهم در غربالگري ايجاد يك كشت خالص است. به عبارت ديگر در اين مرحله تلاش مي شود نمونه مشخصي از ريزجلبك كه فاقد هر نوع ارگانيسم ديگري از جمله باكتري، قارچ، پروتوزوا و غيره باشد، موردكشت قرارگيرد. از جمله روشهايي كه به اين منظور استفاده مي شود مي توان به موارد زير اشاره كرد.
استفاده از جهت تابش نور: ريزجلبكها به دليل تمايل بالايي كه به نور دارند در معرض نور مناسب تجمع مي يابند. البته ذكراين نكته نيز ضروري است كه شدت بالاي نور امكان ايجادآثار معكوسي نظير دوري گزيني ريزجلبكها از نور را سبب مي شود كه در اين صورت رشدي مشاهده نمي گردد. در صورت استفاده از روش تيمار نوري، در ظروفي كاملاً پوشيده و تاريك،منفذي باريك جهت تابش نور ايجادمي كنيم. در اين صورت فقط دستهاي از ريزجلبكها خصوصاً انواع تاژكدار به سمت منفذ نوراني حركت مي كنند و در حوالي آن تجمع مييابند كه مي توان آنها را به كمك يك پيپت از مناطق مذكور جمع آوري نمود. به دليل افزايش تراكم سلولهاي فتوسنتزكننده در آن مناطق، مراحل بعدي خالص سازي راحت تر و سريعترانجام خواهدشد . (Bellinger, et al,1992 )
1-6-5-1- شستشوي سلول: يكي از علل آلودگي، چسبيدن و اتصال سلولهاي ديگر به ريزجلبك مورد نظراست. در اين روش، پس از برداشت سلولهاي ريزجلبك اوليه به كمك يك ميكروپيپت آن را چندين بار به محيطهاي مايع و استريل وارد ميكنند. تكرار اين عمل به محيط كشت تازه و كشيدن مجدد آن مي تواند ساير ميكروارگانيسمهاي آلوده كننده را حذف كند. (Bellinger, et al, 1992)
1-6-5-2- رقيق سازي سريالي21 : اين روش كه بطور معمول جهت خالص سازي باكتريها بكارمي رود،براساس شانس و احتمال حضور يك ميكروارگانيسم خاص در رقت هاي بسيار پايين پايه گذاري شده است. براي انجام آن، ابتدا محيط هاي مايع و استريلي كه مخصوص رشد ريزجلبك هدف است فراهم مي گردد. نمونه مورد نظر پس از طي مراحل اوليه آماده مي شود و به اولين لوله حاوي محيط كشت مايع انتقال مي يابد. حجم معيني (مثلاً 2 ميليليتر) از لوله اول حاوي ميكروارگانيسم به لوله بعدي افزوده مي شود. پس از همزدن و مخلوط كردن، مجدداً همان حجم معين از لوله دوم به لوله سوم منتقل مي گردد تا به آخرين لوله كه بالاترين رقت از ارگانيسم هدف فراهم شده باشد اين عمل تكرارمي شود. مقادير مشخصي از مايع درون لوله ها به پليتهاي حاوي آگار و محيط كشت اختصاصي ريزجلبك منتقل مي شود و فرصت و شرايط لازم جهت رشد آنها فراهم مي گردد. در اين صورت احتمال حضور ميكروارگانيسم آلوده كننده كمتر خواهدبود. اين عمل احتمال خلوص ريزجلبك منتخب را افزايش مي دهد. . (Bellinger, et al ,1992)
1-6-5-3- سانتريفوژ شيب چگالي22 : در صورت ايجاد يك محدوده شيب چگالي به كمك تركيباتي ويژه و با استفاده از يك سانتريفوژ، امكان جداسازي ريزجلبكها از نمونه وجود دارد. از آنجا كه چگالي مربوط به سلولهاي ريزجلبكي در مقايسه با باكتريها متفاوت است با استفاده از اين تكنيك مي توان ريزجلبكها را از باكتريها جدا نمود. در يكي از اين روشها از تركيب سيليكاسل پركول 23 به جهت ايجاد شيب چگالي و متعاقب آن، جداسازي ريزجلبكها استفاده مي شود.
1-6-5-4- تابش نور ماوراء بنفش: اغلب جلبكها در مقايسه با باكتريها مقاومت بيشتري در برابر تابش نورUV از خود نشان مي دهند. بنابراين به دنبال تاباندن اشعه UVسپس شستشو، رقيق سازي نمونه و اسپري كردن بر سطح يك محيط انتخابي حاوي آگار احتمال بدست آوردن يك كشت خالص از ريزجلبك بالا مي رود (. (Kuzmina, et al, 2004
1-6-5-5- صاف كردن: جلبكهاي بزرگ و ريزجلبكهاي رشته اي را مي توان به كمك يك فيلتراسيون ساده از باكتريها جداسازي نمود. رشته هاي جداشده را مي توان با استفاده از دستگاه سونيكاتور به رشته هايي با طول كمتر (3 تا 5سلول) تبديل نمود و سپس نمونه هاي رقيق شده در پشت فيلتر را به محيط كشت مناسب منتقل كرد(. (Kuzmina, et al, 2004
1-6-5-6- استفاده از آنتي بيوتيكها: چندين نوع آنتي بيوتيك به طور مؤثر در حذف آلودگي باكتريايي از جلبكها مورد استفاده قرارگرفته اند. مثلاً محيط آگاردار حاوي ايميپنم24 به ميزان( 100 میکروگرم در میلی لیتر) جهت خالص سازي ريزجلبكهاي يوكاريوتي و همچنين تك سلولي بكارمي رود.( نيستا نین25 به ميزان 100 ميكروگرم در ميلي ليتر) و نيز سيكلوهگزيميد براي حذف آلودگيهاي قارچي و خالص سازي انواع سيانوباكتريها بكارمي رود . (Kuzmina, et al, 2004)
1-6-6- شناسايي ريزجلبكهاي جداشده
مرحله پس از غربالگري اوليه، جداسازي و خالص سازي ريزجلبكها از نمونه هاي محيطي، شناسايي آنها است. شناسايي اوليه شامل تهيه اسلايد و مشاهده ميكروسكوپي مي باشد. پس از تهيه اسلايدها مانند آنچه كه در روشهاي ميكروبيولوژي انجام مي گيرد از اضافه كردن گليسيرين هنگام قراردادن لامل روي لام و روش مشاهده مستقيم نمونه توسط ميكروسكوپ استفاده مي شود. براي مشاهده غلاف اطراف سلولها مي توان از روش رنگ آميزي لوگل استفاده كرد. در صورتي كه براي مشاهده ميكروسكوپي ريزجلبكها لازم باشد از حركت سريع آنها جلوگيري كنيم، ميتوان از فرمالين 4 درصد يا محلول )فرمالين، اسيداستيك، الكل (جهت تثبيت يا بي تحرك سازي استفاده نمود. در مرحله مقدماتي شناسايي ريزجلبكها از ويژگيهاي مورفولوژي يا ظاهري آنها استفاده مي شود. منابع معتبر متعددي جهت بررسي كليدهاي شناسايي جلبكها وجود دارند كه از ميان آنها مي توان به كتب بلينگر 2 اشاره كرد ( Bellinger, et al 1992).
1-6-6-1- شناسايي ريزجلبكها به كمك آناليز مولكولي 18S rDNA
از آنجا كه به دليل تنوع بسيار زياد گونه هاي ريزجلبكي ممكن است روشهاي معمول مانند مشاهده ميكروسكوپي و مطالعات مورفولوژي در شناسايي آنها كافي نباشد و از طرفي با توجه به پيشرفت روزافزون روشهاي بيولوژي مولكولي و سرعت بالا و همچنين اطمينان و راحتي شناسايي آنها از طريق مقايسه ژنهاي محافظت شده26 3 در سطح جنس و گونه ريزجلبكها، رويكرد استفاده از آناليزمولکولی 18S rDNA روشي مناسب خواهد بود. در دهه هاي اخير روشهاي آناليز مولكولي در شناسايي ميكروارگانيسمهاي مختلف بر اساس بررسي توالي ژن كدكننده زيرواحدهاي سازنده RNA های ريبوزومي گسترش قابل توجهي يافته است. ناحيه كدكننده ژن16 S rDNA باكتريها به شدت حفاظت شده است و مي توان توالي ژن كدكننده اين بخش از ژنوم باكتري را پس از تكثير به كمك تكنيك27 PCR توالي يابي كرد . با واردكردن اين توالي در بانكهاي جهاني ژن 28 ميتوان ارگانيسم داراي آن توالي را شناسايي نمود. اخيراً همين روش در خصوص ريز جلبكهاي يوكاريوتي با يافتن پرايمرهاي 29مناسب جهت تكثير ژن كدكننده18srDNA توسعه يافته است. براي اين منظور ابتدا بايد DNA ريزجلبك را استخراج نمود، ناحيه كدكننده ژن18SrDNA را با استفاده ازPCR تكثيركرد و سپس توالي ژن را تعيين نمود.در مرحله نهايي با مقايسه اين توالي در بانكهاي جهاني ژني، ريزجلبك مورد نظر با احتما ل بالايي شناسايي مي شود. (Berad , et al,2005, Simon,etal,2000)
1-6-6-2- انجام عمليات BLAST جهت شناسايي سويه ريزجلبك
به منظور مقايسه ميزان شباهت توالي ژن srDNA 18 حاصل از مراحل قبل با توالي ژن هاي موجود در بانك هاي جهاني ژن و شناسايي ارگانيسم مورد آزمايش عمليات BLAST انجام مي گيرد. يكي از معتبرترين آنهاNCBI است به اين منظور، با مراجعه به آدرس http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ وارد سايت شده و گزينه BLAST انتخاب مي شود. با انتخاب گزينه Nucleotide BLAST و سپس واردكردن توالي مورد نظر و انتخاب كليدBLAST فهرستي از ژن هاي مشابه با ژن هدف و نام ارگانيسمهاي مربوطه مشاهده مي گردد. در نهايت، توالي اين ژن با تواليهاي موجود در بانك ژن مقايسه و ارگانيسم هدف مورد شناسايي قرارمي گيرد.. DDBJ بانك ژني ديگري است كه توسط محققان ژاپني طراحي شده و براي استفاده از آن مي توان به سایت http://www.ddbj.nig.ac.jp مراجعه نمود. Doyle, et al, 1990 ) ).
1-7- تکنیک های استخراج از جلبک ها
تکنیک های استخراج مرسوم همچون استخراج جامد- مایع، (SLE)30 ،Soxhlet ، یا استخراج مایع- مایع(LLE)31 با بکار بردن حجم های بالایی از حلال ها و زمان های استخراج طولانی مشخص شده اند. این تکنیک ها اغلب میزان اندکی از عصاره حاصل از ترکیبات زیستی را به دست می دهند و از قدرت انتخاب پذیری پایینی برخوردار هستند. به علاوه تکنیک های عصاره گیری مرسوم فرآیندهایی خودکار نیستند و بنابراین تکثیرپذیری آنها مورد شک است. استفاده از تکنیک های استخراج جدید همچون استخراج مایع supercritical32(SFE)، استخراج مایع با تنظیم فشار،(PLE)، استخراج حلال تسریع کننده (ASE®)، استخراج با آب داغ با تنظیم فشاری (PHWE)33، استخراج به کمک اولتراسوند(UAE)34، استخراج به کمک مایکروویو(MAE)35، در بین سایر تکنیک ها ممکن است یک جایگزین مناسب برای غلبه بر مشکلات استفاده از روش های استخراج رایج باشند. Ibañez et al. , 2011)).
رادیکال های آزاد و گونه های اکسیژن واکنشگر (ROS)36 ایجاد شده توسط متابولیسم میکروزومال37 ممکن است استرس اکسیداتیو را توسط تشکیل پراکسید هیدروژن یا آنیون های سوپر اکسید در انسان افزایش دهد. شواهد جمع آوری شده نشان می دهد که رادیکال های آزاد و گونه های اکسیژن واکنشگر می توانند مولکولهای زیستی مهمی همچون DNA ، پروتیین ها، لیپید ها را تحت تأثیر قرار دهد و بیماری های تخریبی مهمی همچون سرطان ، زخم های دستگاه گوارش، آلزایمر، آرتریت را ایجاد کند. اهمیت رژیم غذایی در جلوگیری از بروز برخی از بیماری ها به خوبی مشخص شده است . ترکیبات آنتی اکسیدانی طبیعی در تجارت مواد غذایی و مواد آرایشی به علت ظرفیت های کاهش رادیکال های آزاد وساطت شده با تخریب سلول ها و بافت ها در انسان بسیار قابل توجه است. بنابر این توجه ویژه ای به رژیم غذایی بر پایه گیاهی طبیعی به عنوان عوامل پیشگیری کننده معطوف است. به طور مرسوم منشأ این رژیم غذایی به وسیله استخراج رایج با حلال های طبیعی به دست آمده است. با این وجود تغییرات قابل توجهی در خواص فیزیکو شیمیایی عصاره ها می تواند عملکرد آنها را تحت تأثیر قرار دهد. بنابر این، این فرآیند های استخراج باید در شرایط و محیط مناسب انجام شود. استخراج دی اکسید کربن38(SC-CO2) یک تکنولوژی پیشرفته است که مزیت های زیادی شامل اثرات زیست محیطی اندک به واسطه نداشتن هیچ حلال یا استخلاف مضر، فقدان سمیت، عدم خورندگی و جداسازی آسان از عصاره ها دارد. بنابراین این روش در حال حاضر به طور گسترده ای در صنعت دارویی و غذایی مورد استفاده قرار می گیرد. در سال های اخیر ادعا شده است که فعالیت آنتی اکسیدان های طبیعی گیاهی با جذب میوه های تازه ، سبزیجات و دمنوش های طبیعی غنی از آنتی اکسیدان های طبیعی اثرات سودمندی در به تعویق انداختن پیری، پیشگیری از بیماری های قلبی عروقی ،التهاب، بیماری های سیستم عصبی همچنین سرطان ها دارند. علاوه بر این به آنتی اکسیدان های طبیعی گرفته شده از منابع دریایی همچون میکرو جلبک ها بیشر توجه شده است. لیپید های باز یافت شده از ریز جلبک ها با روش های متعددی استخراج می شوند. به دلیل ماهیت ریز جلبک ها روش های استخراج معمول(برای مثال روش استخراج برای غذا) کاربردی نیستند.اول اینکه ریز جلبک ها تک سلولی هستند و توسط دیواره سلولی منحصر به فردی احاطه شده اند. بعلاوه اغلب این جلبک ها حاوی رده های لیپیدی “غیر معمول” و اسید های چرب متفاوتی نسبت به رده های بالاتر گیاهی و جانوری هستند. به این دلایل لازم است تا نگاه عمیقی در رابطه با روشهای استخراج لیپیدها از ریز جلبک ها وجود داشته باشد. (Ryckebosch et al ,2011)
به منظور استخراج این لیپیدها حلال های مختلفی به کار رفته است اما استفاده از بیشتر حلال های آلی کاربردی در صنایع به علت سمیت آنها یا کاهش لایه ازن قدغن شده است. به ویژه ترکیبات آلی فرار 39(VOCs) که عمدتا از کربن و هیدروژن تشکیل شده اند می توانند به آسانی به شکل گازی در اتمسفر به تروپوسفر برسند و بنابراین باعث کاهش لایه ازن شوند. از طرف دیگر (VOCs), حتی در مقادیر ناچیز هم بر روی سلامتی اثراتی نامطلوب دارند. کاربردسیالات فوق بحرانی به عنوان حلال های استخراج برای جایگزینی به ویژه در زمینه تولید سوخت های زیستی برای بهبود اثرات زیست محیطی راهی امیدوار کننده به نظر می رسد. سیال فوق بحرانی مورد استفاده دی اکسید کربن است این سیال فراوان، غیر قابل احتراق، کند از لحاظ شیمیایی، غیر سمی برای اپراتورها ارزان و دارای نقطه بحرانی در دسترس (31ċ/7.4) مگا پاسکال است. دی اکسید کربن فوق بحرانی می تواند اسیدهای چرب آلی و غیر قطبی را حل و استخراج کند. دستکاری درجه حرارت و فشار بالا نقاط بحرانی خواص دی اکسید کربن فوق بحرانی را تحت تأثیر قرار می دهد و توانایی دی اکسید کربن فوق بحرانی برای نفوذ و استخراج مولکولهای هدف را افزایش می دهد. روش های رایج استفاده شده برای جداسازی جزء به جزء اسیدهای چرب چندگانه غیر اشباع مختلف اشکالاتی عمده دارد. استخراج با حلال، احتمالاهمراه با رزین های کروماتوگرافی 40HPLC شامل حضور بقایای حلال درفرآورده نهایی است. کارهای تحقیقی متعددی برای مطالعه امکان استخراج لیپید با دی اکسید کربن فوق بحرانی SCCO2 انجام شده است. برای بهبود بهره وری استخراج چربی، پیش تیمار حرارتی می تواند مورد استفاده قرار گیرد. مایکروویو هم به عنوان راهی جایگزین توانایی نفوذ عمقی به ساختار دیواره



قیمت: تومان

دسته بندی : پایان نامه ارشد

پاسخ دهید